近日北京生命科学研究所黄牛教授课题组在bioRxiv上发表了通过PROTAC技术探索索拉非尼的靶点的工作。
索拉非尼是一种多激酶抑制剂，广泛应用于肿瘤治疗。Sorafenib对多种蛋白激酶有抑制作用，包括Raf-1 (IC50 = 6 nM)、BRAF (IC50 = 22 nM)、c-KIT (IC50 = 58 nM)、FLT3 (IC50 = 58 nM)、VEGFR2 (IC50 = 90 nM)和PDGFR inhibitor (IC50 = 57 nM)。在之前的研究中，他们通过虚拟筛选发现索拉非尼是一种非激酶靶向5- ht受体的纳米级配体(Ki =56和417 nM分别针对5- HT2B和5- ht2c)。最近，5-HT2B受体也被认为是治疗肝纤维化的一个有前景的靶点。鉴于索拉非尼的多靶性，为了更好地研究其在肝纤维化领域地作用，需要确定其靶点。
多激酶抑制剂索拉非尼主要通过其N-甲基吡啶酰胺基团和ATP结合位点铰链区之间形成两个氢键与目标激酶结合。他们在N-甲基吡啶酰胺基团处连接linker，通过三乙二醇链与沙利多胺相连。随后测试了索拉非尼已知的激酶靶点，包括BRAF、c-KIT、FLT3、P38α、VEGFR2和PDGFRβ。与索拉非尼相比，PROTAC T-S在浓度为0.1±M时，这些靶点的抑制活性下降了2倍以上，P38除外。
为了进一步探索PROTAC T-S降解的潜在靶点，他们应用了基于串联质量标签(TMT)的定量蛋白质组学方法来监测蛋白折叠在细胞水平上的变化。沙利度胺被用作阴性对照2uM PROTAC T-S或沙利度胺处理AML12细胞12小时后的蛋白质组学结果显示5749个蛋白中只有6个蛋白显著下调超过30%。在这6个靶点中(PDE、、P38、、ATXN10、BCCIP、MAP3K20、、MAPK2)，PDEδ被最有效地降解，与沙利多胺处理组相比，PROTAC T-S处理后蛋白表达下降超过80%。
随后，他们通过竞争性试验、CRBN敲除以及蛋白酶体抑制剂得方法验证了PROTAC T-S得降解是通过泛素-蛋白酶体得降解机制进行的。
然后，他们进行了CETSA试验，与高活性的PDEδ结合配体Deltarasin相比，索拉菲尼也可以很好地增强PDEδ地稳定性，证明了PDEδ的确是索拉菲尼的靶点。此外，他们还通过SPR法分析了索拉菲尼与PDEδ的相互作用，索拉非尼(Sorafenib)和PROTAC T-S表现出相似的结合活性，分别为1.23μM 和2.26μM.
为了进一步验证索拉菲尼和PDEδ位点之间的结合作用，他们进行了Dock ing分析，其中索拉菲尼深埋在PDEδ的疏水口袋中，索拉非尼的尿素氧和甲基甲酰胺氧原子分别与PDE的Arg61和Tyr149位点形成氢键。为了验证提出的模型，他们将Tyr149突变为丙氨酸(Y149A)来破坏氢键。与预期的一样，在PROTAC T-S存在的情况下，PDE的突变蛋白不再降解。
总结一下，这篇文章报道了索拉非尼基多目标降解剂PROTAC T-S的设计和合成。结合定量蛋白质组学，发现PROTAC T-S可以降解非激酶靶点PDEδ可能是PROTAC T-S和索拉非尼的潜在靶点。PROTAC T-S可能是研究PDE在细胞中的作用的强效化合物。通过CETSA和SPR检测，证实了PDE位点和索拉非尼之间的直接结合作用。并且进一步剖析了索拉非尼- PDE的分子基础相互作用，索拉非尼-激酶晶体结构中存在的甲基甲酰胺氧原子(而不是氮原子)与PDE6的Tyr149位点形成氢键。
