CRISPR/Cas9基因组编辑技术由于简便性和高效性，已经被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前最广泛使用的酿脓链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9），由于脱靶性、细胞毒性、大尺寸（1368个氨基酸）和严格的PAM识别等性质严重限制了其在疾病治疗等领域的应用。发掘和改造来自不同物种中的Cas9核酸酶是解决目前CRISPR/Cas9技术问题的一种行之有效的方法。嗜热链球菌St1Cas9是最早发现的Cas9核酸酶之一，具有尺寸小（1121个氨基酸，适用于单个AAV载体组装）、脱靶率低、低细胞毒性等优点，并且近年来报道了其在哺乳动物细胞中具有较高的基因编辑活性，具有潜在的临床应用价值，然而其严格的PAM识别特性限制了其可编辑的位点。 近日，上海科技大学季泉江（点击查看介绍）课题组与复旦大学甘建华（点击查看介绍）课题组合作在Nature Catalysis发表研究论文，解析了Cas9核酸酶罕见的催化状态结构，揭示了嗜热链球菌Cas9核酸酶（Streptococcus thermophilus Cas9，St1Cas9）的催化机制和PAM DNA识别机制，并基于这些机制进化拓展了St1Cas9 PAM DNA识别，为Cas9核酸酶工作机制的理解和定向进化奠定了重要基础。 图1. HNH核酸酶结构域催化状态结构 St1Cas9不同于其它Cas9核酸酶的生物化学性质暗示其不同的DNA识别和催化机制。为了阐明St1Cas9的工作机制，研究人员成功解析了St1Cas9-sgRNA-DNA的三元复合物晶体结构，并且意外发现其中的Cas9核酸酶处于DNA切割的催化活性状态，清晰揭示了HNH核酸酶结构域切割DNA靶向链的分子机制（图1）。Cas9的HNH核酸酶结构域具有较高的柔性，因而在目前解析的Cas9复合物结构中，HNH核酸酶结构域大多处于非活性状态。进一步分析发现，St1Cas9具有独一无二的“wing”区域。wing区域主要由两个β折叠组成，通过氢键、盐桥以及范德华力将HNH核酸酶结构域稳定在活性状态，起到调控St1Cas9切割活性以及脱靶活性的作用（图2）。 图2. wing区域的性质与功能 该研究同时揭示了St1Cas9识别不同PAM DNA的分子机制。不同于目前已有的Cas9家族的PAM识别机制，St1Cas9同时运用氢键和范德华力来识别较为复杂的NNAGAA PAM DNA （N为任意碱基），丰富了Cas9家族PAM识别机制（图3）。为了拓展St1Cas9 PAM DNA识别，研究人员依据其分子机制进行定向进化，通过引入D939K/E1057L/N1081K/K1086L这四种氨基酸突变，构建了St1Cas9的KLKL变体，消除St1Cas9对PAM DNA第四号位碱基特异性的相互作用并补以非碱基特异性的相互作用，成功地将St1Cas9的PAM识别范围从野生型的NNAGAA拓展为NNRNAA（N为任意碱基，R为A或G碱基），扩大了St1Cas9的基因编辑范围，具有更为广阔的应用前景（图4）。 图3. PAM DNA识别机制 图4. St1Cas9定向进化 季泉江课题组博士研究生张翼飞和张洪源分别为论文第一、第二作者，季泉江教授和复旦大学甘建华教授为论文共同通讯作者，上海科技大学iHuman研究所赵素文教授和博士研究生许雪霞参与了此项研究，上海科技大学生命学院黄行许教授为该研究提供了宝贵意见。
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