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Cell:从结构上揭示新冠病毒复制/转录复合物中解旋酶-聚合酶偶联机制
来源:     时间 : 2020-08-04

冠状病毒属于套式病毒(Nidovirales)目,是一类正链RNA(+RNA)病毒。这些病毒是几种人畜共患传染病的罪魁祸首。致命的事件包括2003年由SARS-CoV引起的严重急性呼吸道综合征(SARS)大流行和由MERS-CoV引起的中东呼吸道综合征(MERS)疫情。作为一种β冠状病毒,SARS-CoV-2已被确定为当前全球破坏性的2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行的原因。

套式病毒包含已知最大的RNA基因组。套式病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp,由非结构蛋白12编码,缩写为nsp12)在RdRp 全酶(holo-RdRp,包括nsp7/nsp82/nsp12)中发挥作用,合成所有病毒RNA分子。RdRp是瑞德西韦等抗病毒药物的靶点。除了在病毒基因组的复制和转录中发挥核心作用外,RdRp还包含一个N端套式病毒RdRp相关的核苷酸转移酶(nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase, NiRAN)结构域,这个结构域功能未知,但具有对病毒传播必不可少的酶活性。

holo-RdRp被认为在病毒生命周期中与一些辅助因子进行协调。这些辅助因子之一是nsp13,它是一种以NTP依赖的方式以5'->3'极性解开DNA或RNA的超家族1B(SF1B)螺旋酶。这种螺旋酶对于套式病毒马动脉炎病毒(equine arteritis virus, EAV)和β冠状病毒小鼠肝炎病毒的复制是必不可少的,并被推测在所有套式病毒中都是必不可少的。这种螺旋酶被认为在病毒生命周期的许多方面发挥着关键作用。除了具有螺旋酶活性,nsp13还具有可能在mRNA加帽中发挥作用的RNA 5'-三磷酸酶活性。

除了具有SF1螺旋酶的两个经典的RecA ATP酶结构域,nsp13还含有套式病毒螺旋酶特有的三个结构域:一个N端锌结合域(ZBD)、一个柄和一个1B结构域。在体内,这些结构域在nsp13功能中的作用尚不清楚,但是这些结构域中或它们之间的界面发生的替换突变对体外螺旋酶的活性以及病毒传播有破坏性影响。

生物化学和生物物理学研究提示着nsp13和nsp12相互作用,但是它们之间形成的一种稳定的复合物尚未通过生物化学手段分离出来,也未从结构上加以表征,而且这种螺旋酶在SARS-CoV-2复制-转录中的机制作用尚不清楚。

图片来自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.033。

在一项新的研究中,来自美国洛克菲勒大学、纽约结构生物中心和瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员获得了稳定的nsp13:holo-RdRp:RNA复合物,并通过低温电镜(cryo-EM)解析出它的三维结构,标称分辨度为3.5埃。这种复合物的结构限制了nsp13的功能模型,并提出nsp13可能促进复制/转录复合物(replication/transcription complex, RTC)向后移动(称为回溯),因而可能影响它的校正和模板切换功能。利用解析出的三维结构,他们还确定了ADP-Mg2+在套式病毒特异性NiRAN结构域活性位点中的结合位置,这为抗病毒治疗开发提供了一个新的靶标。相关研究结果于2020年7月28日在线发表在Cell期刊上,论文标题为“Structural basis for helicase-polymerase coupling in the SARS-CoV-2 replication-transcription complex”。

在nsp13:holo-RdRp:RNA复合物的结构中,螺旋酶nsp13与RTC的主要相互作用决定因素发生在nsp13-ZBD和nsp8-N末端延伸片段之间。这两个结构元素都是套式病毒所特有的,并且它们的相互作用界面在α冠状病毒和β冠状病毒属内是保守的,这表明这种相互作用代表了SARS-CoV-2复制/转录的一个关键方面。在之前的研究中,对SARS-CoV-1 ORFeome进行的蛋白-蛋白相互作用分析已确定了nsp8是病毒蛋白-蛋白相互作用的中心枢纽。nsp8a和nsp8b的结构架构,以及它们的长N端螺旋延伸,为一系列复制/转录因子的结合提供了一个大的结合面。

这种复合物的结构揭示ADP-Mg2+占据NiRAN结构域的活性位点,这可能是因为RdRp样品在网格制备之前用ADP-AlF3孵育。ADP与nsp13没有发生碱基特异性相互作用;nsp12-NiRAN-H75与腺嘌呤碱基形成阳离子-π相互作用,但是这种相互作用预计不是强烈的碱基特异性,结构建模也没有为碱基特异性相互作用提供明显的备选方案。在NiRAN结构域An对齐中,对应于H75的位置并不是保守的,这表明;i)这个氨基酸残基不是NiRAN结构域活性位点的碱基特异性的决定因素,ii)NiRAN结构域的碱基特异性在不同的套式病毒之间存在差异,或者iii)在一般情况下,NiRAN结构域的活性不表现出碱基特异性。

这些作者注意到NiRAN结构域的酶活性对病毒传播至关重要,但是它的作用靶标是未知的。需要开展进一步的实验才能更全面地了解NiRAN结构域的活性、它的首选底物以及它的体内靶标,而这些可能在不同的套式病毒中有所不同。这些结果为研究这些问题的生化、生物物理和基因实验提供了结构基础,也为抗病毒药物开发平台提供了结构基础。