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揭秘细胞糖链之谜
来源:     时间 : 2020-03-26

图为一个帮助冠状病毒(coronaviruses)附着在细胞上的糖蛋白突刺的三维结构。这个糖链含有阻止抗体结合的聚糖。

研究人员终于揭开了糖链的真相。糖链包裹着细胞,并修饰着许多蛋白质。

虽然合成世界上所有的蛋白质只需要22个氨基酸,编码遗传信息只需要4种核苷酸碱基,但是,位于孟买的印度理工学院(Indian Institute of Technology)的生物信息学家Jaya Srivastava指出,关于另一类同样重要的、名为聚糖的生物分子,科学家甚至不知道是否存在一个类似的成分表,细胞可以通过它来制造聚糖。

聚糖是一种以糖为基础的聚合物,细胞表面有聚糖包裹,并且大多数蛋白质都携带聚糖修饰。这些聚糖对免疫调节和细胞间相互作用等生物过程至关重要。这使得糖链的合成信息的明显缺乏令人吃惊,并反映了一个长期存在的问题:科学家对糖的了解实在少之又少。

30多年前,化学家Carolyn Bertozzi震惊于人们的糖蛋白的化学信息非常匮乏。至少有一半的哺乳动物蛋白是糖基化的,这意味着它们至少有一个糖基。如果没有正确的糖基修饰,蛋白质就会折叠错误或变得不稳定或无功能。现任职于加州斯坦福大学(Stanford University)的Bertozzi表示,尽管聚糖在生物学上的重要性在20世纪80年代就得到了充分的证实,但是生物学家还是很难回答任何有关糖科学(glycoscience)的问题,因为他们没有工具。

虽然蛋白质和DNA在实验室里很容易被操纵,但对聚糖来说却并非如此。鉴于此,人们对糖的研究远远落后于对其它大分子的研究。这在一定程度上是因为聚糖不是使用任何已知模板合成的,它们可以根据细胞的代谢状态发生动态变化。更重要的是,糖同分异构体——具有相同的化学公式,但不同结构的分子——尽管可以用于构建不同的聚糖,但几乎不可能仅根据分子量来区分彼此。

2015年,NIH建立了“糖科学共同基金”(Common Fund Glycoscience)的项目,以开发生物医学中研究糖基化合物的技术。当时,研究人员认为缺乏工具是糖生物学的最大障碍。现在,他们开始着手解决这个问题。

Bertozzi等人开创了在活组织或固定组织中成像的方法。由于质谱和拉曼光谱的改进,研究人员可以更容易地识别和表征糖蛋白。包括Srivastava在内的几位科学家正在开发开放性数据库,如UniCarbKB、GlyTouCan和Glycan质谱数据库。这些数据库可用于识别糖和蛋白质上常见的糖基化位点。其他公司则专注于高通量技术,包括能同时从数百个聚糖或糖蛋白中捕获数据的阵列。

Bertozzi指出,过去一个博士可能需要横跨整个博士在读年份才能完成特定样品的糖蛋白分析,现在只需要几周就可以完成了。对他来说,这就像是这个领域的一个转折点。 

糖链可视化

1996年,Bertozzi 在加州大学伯克利分校(University of California, Berkeley)成立了她的第一个实验室,并着手研究一个基础工具:可视化一个细胞上的糖,就像用荧光标记蛋白质,然后在显微镜下观察蛋白质定位和表达一样。

她开发的技术被称为生物偶联化学(bio-orthogonal chemistry),现在已被广泛应用。该技术依赖于在糖上标记一个小的、在生物学上不反应的化学基团,将糖基连接到蛋白质上的酶也不会作用于这个化学基团。一旦这种标记过的糖被整合进一个复杂的糖链中,并被连接到蛋白质上,一种荧光染料就可以被吸附到细胞中的化学基团上,从而使糖链在显微镜下呈现出来。

Bertozzi表示,关键是我们需要找到两个能相互反应的官能团,但这两个官能团不能与身体里的其他任何成分发生反应。这种“生物偶联性”是有价值的:在生物世界里,它们应该无法通过化学方法被识别(生物酶不会降解这些基团或影响这些化学基团的功能)。她和她的同事已经应用生物偶联工具来研究诸多课题,例如:识别前列腺癌组织中异常丰富或独特的糖蛋白;用它们来追踪不同表面糖蛋白的细胞在发育过程中迁移到斑马鱼颚部的差异;等等。

现在,其他人正在扩展这个概念。斯克里普斯研究中心(Scripps Research)的化学糖生物学家Peng Wu等人放弃了这种方法:利用化学基团与糖连接,然后使其与染料或抗体偶联;相反,他们设计了一种新方法:将糖和染料直接相连。这种方法是可行的,因为即使糖底物携带了大量的荧光染料或标记抗体,许多合成糖基的酶仍然会将其连接到糖链上。Wu指出,在糖聚合反应中,糖中间体的分子量是400-500道尔顿,没人想过把分子量为150千道尔顿的抗体引入糖中,还能让糖聚合反应继续进行。

在去年的一项研究中,Wu的团队给单细胞阶段的斑马鱼胚胎注射了两种染料标记的糖,并通过共聚焦显微镜追踪标记的分子。与两步生物偶联化学反应相比,这些经过标记的糖产生了更强的深层组织信号,如在斑马鱼头部产生信号。

 

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图为用质谱法定位人乳腺癌组织中的N -聚糖(右图),并与用典型细胞染色法染色的组织切片进行比较(左图)。

丰富的阵列

这样的工具可以揭示多糖代谢的一些方面,但如果要想了解更多糖组学方面的信息,包括细胞的聚糖,那么糖生物学家就需要一套不同的工具。加拿大埃德蒙顿阿尔伯塔大学(University of Alberta)的化学家Lara Mahal表示,糖科学如果想要跟上蛋白质组学等领域的进步,那么高通量方法至关重要。

例如,2002年,研究人员将基因组学中最早期的高通量工具之一——DNA微阵列(DNA microarray)应用于糖科学。糖阵列是一张芯片,上面点缀着合成聚合物,有助于识别与糖结合的蛋白质。通过使用这种糖阵列,研究人员已经取得了一些成果,例如,识别人类和禽流感病毒的细胞结合位点之间的差异。虽然糖链阵列以高密度的方式呈现糖,但是不识别与其连接的细胞蛋白和脂质。鉴于此,它们无法反映真正的生物相互作用。所以Mahal转向了天然的原始聚糖结合物——名为凝集素的蛋白质。通过将这些糖链放入一个阵列中,她创造了一种工具,可以与样本中所有的糖链结合,不管这些糖链是孤立的糖片段,还是附着在蛋白质、脂质或其他生物分子上。

为了揭示蛋白质上聚糖的多样性和丰富性,目前研究人员正在将这些方法与代谢组学和蛋白质组学研究的工具——MALDI质谱成像相结合。质谱分析可以根据分子的质量和离子电荷来鉴定分子。南卡罗莱纳医科大学(Medical University of South Carolina)的蛋白质组学研究Anand Mehta等人联用了质谱仪成像和糖蛋白抗体阵列,检测了人类血清(包含成百上千的糖化蛋白)等样品中不同蛋白结合的聚糖的相对含量。Mehta 表示,在肝硬化、癌症或其它疾病中,你能很快看到哪些蛋白质的糖基化模式发生了改变。

在哥本哈根大学(University of Copenhagen),糖科学家Henrik Clausen和他的团队设计了一种基于细胞的糖链阵列,方法是将一种名为HEK293的普通细胞系中的糖去除,然后重新引入170种糖链合成酶基因。不同的细胞亚群表达不同的酶——因此,表达不同的表面糖蛋白——本质上每种细胞亚型都会成为一个阵列上的点。但是研究人员并没有使用微阵列阅读器成像,而是使用流式细胞技术,用激光扫描单个细胞来识别结合分子。Clausen指出,把目光转向酶而不是单独的糖结构,给糖组学研究赋予了生物学意义。你不仅能了解它们与什么结构结合,还能发现哪些基因和酶参与了这种结构的形成。 

糖链位置

Clausen还致力于解决糖生物学中另一个令人烦恼的问题。尽管在理解糖的复杂结构方面取得了重大进展,Clausen指出,在无偏性分析中,我们还远远不能理解哪些糖位于哪些蛋白上的哪些位置。

去年,位于马里兰州盖瑟斯堡的美国国家标准与技术研究所(US National Institute of Standards and Technology)向全球76家实验室提供了一种特定的糖基化抗体样本,并要求它们识别抗体蛋白中存在的糖及其位置。研究小组报告了三大类含唾液酸、岩藻糖、半乳糖或其衍生物的聚糖。但他们的详细评估大相径庭。

利用质谱分析,研究人员有效地识别了糖链,但在许多情况下未能区分糖异构体。实验室还在研究O-连接聚糖(O-linked glycans)。这种糖在氨基酸中与氧原子相连。没有特定的氨基酸或序列来标记O-连接聚糖的位置。尽管许多分析工具需要将聚糖从它们的蛋白质骨架中分离出来才能检测,但没有一种单一的酶可以分离所有类型的O-连接聚糖。Clausen表示,相比之下,N-连接聚糖则与蛋白质上的一个由四种氨基酸组成的保守序列中的天冬酰胺残基相连,它们都可以被一种酶切掉,而这种酶会在蛋白质上留下一个独特的分子“疤痕”。“这就是为什么我们对N-糖蛋白组的了解——不是从结构上而是从糖的位置上——比所有O-连接聚糖早了几十年的原因。

去年,Clausen的团队开发了一种方法,试图缩小这一差距。首先,研究小组使用其基于细胞的糖链阵列,为2000多种糖蛋白的O-连接聚糖创建了一个质谱文库。利用这项技术,研究小组能够检测,并量化了269个O-连接聚糖,而不需要预先设定离子和光谱的范围——这些参数目前只适用于N-连接聚糖。

其他研究小组则采用了拉曼光谱法,一种利用分子振动光谱作为特征的方法,来观察细胞表面的聚糖。一项研究将这种方法应用于活组织,并确定了乳腺癌和脑癌细胞特有的糖基化模式。斯坦福大学的放射学研究员Sharon Pitteri指出,到目前为止,大多数拉曼研究都集中在简单的模型蛋白上,所以看到它被用在真实的生物样本上真的很有趣。

澳大利亚皇家墨尔本理工大学(RMIT University)的物理化学家Ewan Blanch指出,拉曼光谱与生物组织中发现的相对丰富的糖“非常匹配”。但由于缺乏参考数据,使用它的尝试受到了阻碍。Pitteri则表示,技术进步正在改善这一现状。过去,研究人员必须把糖从蛋白质中分离出来,并分别研究糖链。现在,他们可以用不同的方法对糖蛋白进行切片,从而在蛋白片段的背景下研究糖,然后将两者分开,分别研究糖和蛋白质。这些工具对O-连接聚糖特别有用。

回归生物学

研究人员还致力于更好地将糖组学与更广泛的生物医学研究结合起来。这样的联系不仅可以人们帮助识别聚糖在癌症、免疫功能障碍或其它疾病中是如何发生改变的,还可以帮助识别它们改变的原因。Clausen指出,如果你告诉一名细胞生物学家,他的蛋白质与di-sialo-fucosyl-polyLacNAc结合,他一点概念都没有。但如果你告诉他,蛋白糖基化需要这4种基因才能表达,他就可以回到遗传学,操纵糖基化。

Mahal提醒,这一步对治疗也至关重要,因为药物开发人员“不太可能针对聚糖,而是针对制造聚糖的酶”。

事实上,大规模的筛选经常将糖链相关酶与各种过程和疾病联系在一起,这使得生物学家有可能——甚至是必要的——与糖科学打交道。Bertozzi表示,当我们聚焦于这些生物学问题时,往往不得不回到糖科学上。

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